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正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義：

維生素B6（Vitamin B6）又稱吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在體內(nèi)以磷酸酯的形式存在，是一種水溶性維生素，在細(xì)胞中參與多種蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝，對(duì)生物體具有極其重要的作用。

測(cè)定原理：

VB6與4-氨基安替比林在強(qiáng)氧化劑作用下生成穩(wěn)定的黃色化合物，在390nm有特征吸收峰。

組成：

自備儀器和用品：

天平、研缽、離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、蒸餾水。

樣本處理：

1. 組織：將樣品磨碎，按照質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入0.6ml提取液）加入提取液，60℃浸提30min，加蒸餾水0.4ml，混勻后于25℃，16000rpm離心10min，取上清測(cè)定（動(dòng)物組織等蛋白含量較高的樣本建議離心20-30分鐘）。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入0.6ml提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；加蒸餾水0.4ml，混勻后于25℃，16000rpm離心10min，取上清測(cè)定。

3. 血清：直接測(cè)定。                

測(cè)定操作：

計(jì)算公式：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.3635x+0.0205，R² = 0.9986

1. 按照蛋白含量計(jì)算

VB6含量（μg/mg prot）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反總÷（V樣×Cpr）

                    = 13.76×（△A - 0.0205）÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

VB6含量（μg/g）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反總÷（V樣×W÷V樣總）

                = 13.76×（△A - 0.0205）÷ W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

VB6含量（μg/10⁴ cell）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）

                     = 13.76×（△A - 0.0205）÷ 細(xì)胞數(shù)量

4. 按照液體體積計(jì)算

VB6含量（μg/ml）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反總÷V樣

                  = 13.76×（△A - 0.0205）

V反總：反應(yīng)總體積，0.2ml；：V樣：加入樣本體積，0.04ml；V樣總：加入提取液體積，1ml； Cpr：蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g

b．用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.1818x+0.0205，R² = 0.9986

1. 按照蛋白含量計(jì)算

VB6含量（μg/mg prot）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V反總÷（V樣×Cpr）

                    = 27.52×（△A - 0.0205）÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

VB6含量（μg/g）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818 ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）

                = 27.52×（△A - 0.0205）÷ W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

VB6含量（μg/10⁴ cell）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）

                     = 27.52×（△A - 0.0205）÷ 細(xì)胞數(shù)量

4. 按照液體體積計(jì)算

VB6含量（μg/ml）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V反總÷V樣

                  =27.52×（△A - 0.0205）

V反總：反應(yīng)總體積，0.2ml；：V樣：加入樣本體積，0.04ml；V樣總：加入提取液體積，1ml； Cpr：蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g

注意事項(xiàng)：

1. 若測(cè)定結(jié)果中吸光值超過(guò)1，請(qǐng)將樣本稀釋后進(jìn)行測(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2. 蛋白濃度較高的樣品，比如動(dòng)物組織，若顯色完成后有沉淀產(chǎn)生，將樣本稀釋后再測(cè)定，在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3. 顯色完成后立即進(jìn)行測(cè)定。