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HaloTag 技術(shù)基于融合蛋白標簽和合成熒光配基之間共價鍵的形成，可用于標記細胞或其 他生化環(huán)境中的目的蛋白以表征和分析其定位及功能。HaloTag 報告基因蛋白是 33kDa 的單體 蛋白，是一種經(jīng)基因工程改造、無催化活性的水解酶衍生物，在生理條件下可以快速和 HaloTag 熒光配體形成不可逆的共價鍵從而實現(xiàn)對目的蛋白的高特異性標記[1]。此技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于 哺乳動物細胞、植物、細菌、酵母和活體模式動物等生物體系。

CA-SiR Ligand 則是一款以四甲基硅羅丹明為母體的遠紅發(fā)射熒光配體，基于其在溶液中 無色親酯的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)和標記在 HaloTag 蛋白后熒光的兩性離子結(jié)構(gòu)之間的高效轉(zhuǎn)換，可以實現(xiàn) 對目標蛋白的“免洗”標記。

CA-TMR Ligand 和 CA-R110 Ligand 是以氧羅丹明為母體的熒光配體，二者皆具有良好 的熒光亮度、較高的光穩(wěn)定性、較低的光毒性和較好的細胞膜滲透能力；目前已廣泛應(yīng)用于寬 場、共聚焦、單分子定位示蹤和 SIM 超分辨成像等多種模態(tài)的成像系統(tǒng)中，其較好的生物相 容性使其可以應(yīng)用于哺乳動物細胞、植物、細菌、酵母等生物體系的熒光成像。

相較于 CA-TMR Ligand 和 CA-R110 Ligand 熒光配體，CA-SiR Ligand 熒光配體不僅具有 良好的熒光亮度、較高的光穩(wěn)定性和較低的光毒性，其極佳的生物相容性和高效的細胞膜滲透能力，使得 CA-SiR Ligand 熒光配體在哺乳動物細胞、植物、細菌、酵母和活體模式動物等生 物體系中有著廣泛的應(yīng)用，并可在除寬場、共聚焦、單分子定位示蹤和 SIM 之外的 STED 超 分辨成像體系中進行活細胞熒光成像。

 3.實驗步驟

3.1  在 CA-SiR Ligand 中加入 50 μL/5 μL 新鮮干燥的 DMSO，混合均勻，得到 1 mM 母液。

3.2 將培養(yǎng)基預(yù)熱至 37 ℃，將 CA-SiR Ligand 母液按照 1000- 5000 倍稀釋比例加入到預(yù)熱的 培養(yǎng)基中，稀釋后的染液建議盡快使用，久置后可能導(dǎo)致部分染料分解或沉淀。

3.3 吸去已經(jīng)表達 Halo-tag 蛋白細胞的培養(yǎng)基，更換為稀釋好的培養(yǎng)基染液，在培養(yǎng)箱中孵育

5-15 分鐘后即可在不更換培養(yǎng)基的情況下進行“免洗”熒光成像。也可以對用預(yù)熱的培養(yǎng)基 清洗細胞一至兩次后用于熒光成像。

注：1、我們建議對大多數(shù)細胞系使用 200-250 nM，如 HeLa、COS7、U-2OS 等；對組織或活 體動物染色使用 500-1000 nM。

2、不同樣品染色條件有所差異，建議起始染色方法為 1000 倍稀釋，15 分鐘染色，請根 據(jù)實際染色效果進行調(diào)整。

3、CA-TMR Ligand 和 CA-R110 Ligand 細胞滲透性熒光配基的實驗步驟類同上述實驗操 作。

 4.參考文獻

1. Los, G. et al. "HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and  protein analysis." ACS Chem. Biol., 2008, 3, 6, 373-382.