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   金黃色鏈霉菌 Tü117 的準(zhǔn)確靈敏檢測(cè)對(duì)于高血壓分類和早期預(yù)警至關(guān)重要。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，開發(fā)了一種雙重組酶聚合酶擴(kuò)增與 crRNA 陣列介導(dǎo)的 CRISPR/Cas12a 檢測(cè)方法（DR-CAMCas），能夠?qū)崿F(xiàn)多信號(hào)輸出，以精確識(shí)別和檢測(cè)金黃色鏈霉菌 Tü117。通過一步雙重 RPA 同時(shí)擴(kuò)增金黃色鏈霉菌 Tü117 的 16S rDNA 和 LipReg4 基因，激活 crRNA 陣列介導(dǎo)的 CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)切割外源 FQ 報(bào)告分子，釋放熒光信號(hào)。DR-CAMCas 具有高擴(kuò)增效率、通過 crRNA 陣列信號(hào)疊加實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)識(shí)別以及 CRISPR/Cas12a 的可編程性，實(shí)現(xiàn)了超靈敏檢測(cè)，線性范圍為 10 至 108 cfu/mL，檢測(cè)限約為 3 cfu/mL。DR-CAMCas 成功地在高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓小鼠和高血壓患者的糞便樣本中檢測(cè)到金黃色鏈霉菌 Tü117，與 qPCR 結(jié)果相符，顯示出高可靠性和實(shí)用性。此外，DR-CAMCas 中的目標(biāo)誘導(dǎo)切割 DNA 連接子使 AuNPs-DNA 探針分散，實(shí)現(xiàn)比色檢測(cè)。整合到側(cè)流傳感器上，DR-CAMCas 可通過簡(jiǎn)單的可視條帶分析進(jìn)行即時(shí)檢測(cè)。其三重信號(hào)輸出滿足不同的檢測(cè)需求，為診斷鹽敏感性高血壓提供了一種有前途的工具。

（A）crRNA 陣列的結(jié)構(gòu)、自由能和瓊脂糖凝膠。（B）crRNA 陣列的識(shí)別位點(diǎn)、雙重 RPA 過程以及 crRNA 陣列介導(dǎo)的 CRISPR/Cas12a 檢測(cè)信號(hào)的疊加效應(yīng)。（C）crRNA 陣列的瓊脂糖凝膠。（D）雙重 RPA 和單獨(dú) RPA 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠。（E、F）使用不同 crRNA 檢測(cè) 16S rDNA 和 LipReg4 基因的熒光光譜（金色鏈霉菌 Tü117：107 cfu/mL）。

單鏈向?qū)?RNA（single crRNA）介導(dǎo)的 CRISPR/Cas12a 與雙重重組酶聚合酶擴(kuò)增（dual RPA）耦合對(duì) 16S rDNA 和 LipReg4 基因的熒光響應(yīng)（A、B）以及隨時(shí)間變化在不同單鏈向?qū)?RNA 存在下的熱圖。（E、F）使用單鏈向?qū)?RNA 介導(dǎo)的 CRISPR/Cas12a 與雙重 RPA 耦合檢測(cè) 16S rDNA 和 LipReg4 基因的檢測(cè)性能。

DR-CAMCas 方法對(duì)金色鏈霉菌 Tü117 檢測(cè)的檢測(cè)性能。（A、B）DR-CAMCas 檢測(cè)對(duì) 16S rDNA 和 LipReg4 基因的熒光響應(yīng)隨時(shí)間變化。（C、D）在不同 crRNA 存在下，由 16S rDNA 和 LipReg4 基因誘導(dǎo)的 DR-CAMCas 終點(diǎn)熒光熱圖。（E）使用 DR-CAMCas 對(duì)金色鏈霉菌 Tü117 的識(shí)別過程。DR-CAMCas（crRNA1 + 2 + 3）對(duì)金色鏈霉菌 Tü117 的 16S rDNA 和 LipReg4 基因的熒光響應(yīng)（H、K）和選擇性（H、K）。（G、J）使用不同 crRNA 組合的 DR-CAMCas 對(duì) 16S rDNA 和 LipReg4 基因的檢測(cè)性能。

（A）高血壓患者和高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓模型小鼠的糞便樣本。（B）金色鏈霉菌 Tü117 的革蘭氏染色。比例尺：20μm。高鹽飲食小鼠對(duì)體重（C）、收縮壓（D）、舒張壓（E）和平均動(dòng)脈壓（F）的影響（n = 12）。（G - J）使用 DR-CAMCas 和 qPCR 檢測(cè)高血壓小鼠糞便樣本中的 16S rDNA 和 LipReg4 基因（對(duì)照組：6 只；血管緊張素 II 組：6 只；高脂飲食組：6 只；高鹽組：24 只）。（L - O）使用 DR-CAMCas 和 qPCR 檢測(cè)臨床樣本（正常人：30 人；高血壓患者：30 人）糞便樣本中的 16S rDNA 和 LipReg4 基因。（K，P）評(píng)估 DR-CAMCas 和 qPCR 在臨床樣本檢測(cè)中的一致性。*p < 0.05 與對(duì)照組相比，**p < 0.01 與對(duì)照組相比，****p < 0.0001 與對(duì)照組相比。

比色探針的表征。金納米粒子的 TEM 圖像（A、B）、映射圖像（C）和 EDS 分析（D）。（B）系列金納米粒子稀釋液的紫外-可見吸收光譜。（F）金納米粒子、金納米粒子-DNA 以及與 DNA 連接子交聯(lián)的金納米粒子-DNA 對(duì)的紫外-可見吸收光譜。（G）用 Arm-DNA 修飾前后的金納米粒子的 Zeta 電位。（H）比色檢測(cè)可行性評(píng)估。使用 DR-CAMCas 測(cè)定法與目標(biāo) DNA 反應(yīng)后比色探針的 TEM 圖像（I）和元素分析（J-M）。使用 DR-CAMCas 測(cè)定法在沒有目標(biāo) DNA 的情況下比色探針的 TEM 圖像（N）和元素分析（O-R）。

金黃色鏈霉菌 Tü117 的比色法和即時(shí)檢測(cè)。（A）金黃色鏈霉菌 Tü117 的肉眼檢測(cè)過程。照片（B、C）金黃色鏈霉菌 Tü117 濃度增加時(shí) 16S rDNA 和 LipReg4 基因肉眼檢測(cè)的紫外-可見吸收光譜（D、H）及相應(yīng)的線性擬合曲線（E、I）。（F、J）比色 DR-CAMCas 方法對(duì)金黃色鏈霉菌 Tü117 檢測(cè)的選擇性。（G、K）比色 DR-CAMCas 檢測(cè)法在高血壓小鼠糞便樣本檢測(cè)中的實(shí)際應(yīng)用。（L）DR-CAMCas 在側(cè)流生物傳感器（LFB）中的整合?；?DR-CAMCas 的 LFB 檢測(cè)法對(duì)金黃色鏈霉菌 Tü117 的 16S rDNA 和 LipReg4 基因檢測(cè)的可行性（M）、檢測(cè)性能（N、P）和選擇性分析（O、Q）

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