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食源性致病菌

      食品安全問題是關(guān)乎人民生命健康和社會和諧的重大戰(zhàn)略問題，而食品致病菌是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致食品安全問題的主要因素。其中, 以金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、單核增生李斯特菌、腸炎沙門氏菌、鮑曼不動桿菌等為代表的食源性致病菌嚴重威脅著消費者的健康, 由其引起的食源性疾病如腹痛、腹瀉以及嘔吐等癥狀近年來呈上升趨勢^[1]，世界衛(wèi)生組織調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在全球范圍內(nèi)每年約有6億例食源性疾病發(fā)生，其中有42萬人因此死亡。因此，盡早的發(fā)現(xiàn)食源性致病菌是防止食源性疾病暴發(fā)的有效手段。

      基于細胞培養(yǎng)的方法盡管一直以來被認為是食源性致病菌檢測的金標準，但該方法需要經(jīng)過增菌、選擇性培養(yǎng)、純化、生化反應(yīng)鑒定等步驟^[2]，存在過程繁瑣，且檢測耗時長等問題，難以滿足目前的快速檢測需求。而基于抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)原理的檢測方法雖然操作相對簡單，但靈敏性不足、容易造成漏檢。因此，開發(fā)新型快速高效的食源性致病菌檢測技術(shù)是亟待解決的重要問題。

 常規(guī)免疫檢測及核酸檢測原理

  CRISPR/Cas系統(tǒng)快速檢測原理

      CRISPR/Cas系統(tǒng)由成簇、規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）和關(guān)聯(lián)蛋白（CRISPR-associated protein，Cas）組成。CRISPR/Cas系統(tǒng)來源于細菌和古細菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)^[4]。近些年發(fā)現(xiàn)的Cas12和Cas13蛋白在CRISPR RNA (crRNA)或向?qū)?RNA (single-guide RNA，sgRNA)引導(dǎo)下，除了具有識別并剪切特異靶標的順式剪切活性外，還具有可被靶標激活的反式剪切活性。即這些 Cas蛋白與crRNA在特異性識別靶標后，可被激活針對ssDNA或ssRNA的反式剪切活性?；诖嗽?，可將反式剪切底物設(shè)計成合適的報告探針(如熒光-淬滅基團修飾)，即可用于靶標核酸檢測。

CRISPR/Cas技術(shù)檢測食源性致病菌

      致病菌的CRISPR/Cas核酸傳感器檢測可分為兩大類：①通過增菌后提取基因組，結(jié)合核酸擴增和Cas蛋白的剪切體系建立的核酸傳感器。②結(jié)合適配體實現(xiàn)致病菌向核酸的轉(zhuǎn)化，隨后直接或間接與CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)合，建立相應(yīng)的傳感器^[5]。在上文中，我們提到了5種常見的食源性致病菌，接下來，編者將以這5種食源性致病菌為例，展開論述現(xiàn)有的CRISPR/Cas檢測系統(tǒng)的原理及進展。

金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的雙重檢測

      Gootenberg^[8]等基于重組酶聚合酶擴增技術(shù) (Recombinase Polymerase Amplification, RPA)和CRISPR/Cas13建立了RPA-CRISPR/Cas-雙重熒光檢測系統(tǒng)。通過多重RPA擴增，再將擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄得到RNA靶標，兩種不同的RNA靶標分別與Cas13a/crRNA、Cas13b/crRNA結(jié)合并激活對應(yīng)Cas13蛋白的反式剪切活性。根據(jù)Cas13蛋白反式剪切探針的偏好性，采取Cas13a剪切poly U探針，Cas13b剪切poly A探針，兩種探針分別標記不同的熒光基團，從而通過檢測兩種熒光信號強度的變化，實現(xiàn)對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的同時檢測。

 RPA-CRISPR/Cas-雙重熒光檢測系統(tǒng)對黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的檢測

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