標(biāo)題：Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9
期刊：Nat Commun
發(fā)表時(shí)間：2021年
影響因子：17.694
摘要
盡管細(xì)胞外囊泡(EVs)在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮作用，但它們的不同種群及其分泌機(jī)制尚未完全表征：EVs如何以及在何種程度上形成為內(nèi)吞隔室腔內(nèi)囊泡 (外泌體) 或在質(zhì)膜 (PM) 上形成囊泡（ectosomes）仍不清楚。該研究跟蹤了EV標(biāo)志物CD9和CD63從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到它們的駐留區(qū)室，分別是PM和晚期內(nèi)體的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸。在它們最終分離之前，觀察到兩個(gè)地方的瞬時(shí)共定位。CD9和穩(wěn)定在PM的突變CD63在EV中比CD63更豐富地釋放。因此，在HeLa細(xì)胞中，ectosomes比外泌體分泌更多。通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析和對內(nèi)體pH中和的差異反應(yīng)，確定了一些可能對外泌體 (LAMP1) 或ectosomes (BSG、SLC3A2) 具有特異性的表面蛋白。該研究工作為任何細(xì)胞類型中外泌體和小ectosomes的分子和功能區(qū)分開辟了道路。
引言
所有細(xì)胞都會在其環(huán)境中釋放膜包裹的囊泡，統(tǒng)稱為細(xì)胞外囊泡 (EV)。這些 EV 包含來自其起源細(xì)胞的一組選定的脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)，因此可以將一系列復(fù)雜的信息傳輸?shù)街車蜻h(yuǎn)處的細(xì)胞。EV 可以通過從原核和真核細(xì)胞的質(zhì)膜 (PM) 直接向外出芽形成。在真核細(xì)胞中，EV 也可以首先作為內(nèi)吞途徑 (MVB) 的內(nèi)部多泡隔室的腔內(nèi)囊泡形成，然后在這些隔室與 PM 融合時(shí)分泌。為了闡明命名法，最近建議專門針對 MVB 衍生的 EV 使用術(shù)語“外泌體”，而不是針對所有小型 EV；另一方面，PM 衍生的 EV 被稱為各種名稱，例如微泡、微?；虬怏w。
由于它們在不同的亞細(xì)胞位點(diǎn)形成，外泌體和胞外體可能包含不同組的特定貨物，因此具有不同的功能。然而，由于難以將生物流體或細(xì)胞條件培養(yǎng)基中存在的相同大小的外泌體與外泌體分離，缺乏區(qū)分外泌體與胞外體的特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記，以及分子機(jī)制和具有對一個(gè)或另一個(gè)完全特異性的工具。
研究結(jié)果
01.CD63 和 CD9 存在于兩個(gè)不同的和一個(gè)共同的 EV 群體中
使用HeLa 細(xì)胞去研究分析EV的分布，免疫熒光結(jié)果表明 CD63 主要位于細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中。相反，CD9 主要存在于質(zhì)膜上，但也存在于罕見的暗淡細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中。在穩(wěn)態(tài)下沒有觀察到兩種蛋白質(zhì)的明顯共定位。
02.CD63 和 CD9 短暫地通過晚期內(nèi)體和 PM
pHluorin在酸性條件下實(shí)際上是無熒光的，但在中性pH時(shí)發(fā)出熒光，因此使其成為觀察酸性晚期胞內(nèi)MVB與質(zhì)膜融合的理想報(bào)告分子。由于細(xì)胞外部環(huán)境處于中性pH，因此在融合過程中會發(fā)生酸到中性的轉(zhuǎn)換。免疫電鏡表明在所有時(shí)間點(diǎn)，大多數(shù) MVB 和溶酶體僅包含 CD63 而不是 CD9。
03. 與 CD63 不同，CD9 和 CD63-YA 具有相似的 PM 定位和內(nèi)化動(dòng)力學(xué)
溶酶體靶向基序進(jìn)行突變?yōu)镃D63-YA，CD63 - WT - eGFP或CD63 - YA - eGFP RUSH 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的 HeLa 細(xì)胞；結(jié)果顯示，在穩(wěn)定狀態(tài)下，與 CD63-WT 相反，CD63-YA 主要位于細(xì)胞外圍和一些小的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中。動(dòng)力監(jiān)測結(jié)果顯示，突變體 CD63-YA 不會進(jìn)入酸性內(nèi)部隔間；同時(shí)，用生物素處理后，結(jié)果顯示CD9 和 CD63-YA 在添加生物素后約 1 小時(shí)達(dá)到相似的表面 (AF647)/總 (GFP) 熒光強(qiáng)度比為 1，在穩(wěn)態(tài)下進(jìn)一步增加至約 2；相比之下，對于 CD63，最大表面/總比值增加但保持低于 1，直到添加生物素后 2 小時(shí)，并在 2 小時(shí)和穩(wěn)態(tài)之間下降，CD63-YA 和 CD9 表現(xiàn)相似并在質(zhì)膜上積累。
04. PM 蛋白在 CD9-EV 中富集，而內(nèi)體/溶酶體和 PM 跨膜蛋白都在 CD63-EV 中富集
為了更好地確定CD63 +和CD9 + EV的起源，并鑒定PM或內(nèi)體釋放的EV的特定標(biāo)志物，研究者進(jìn)行了定量質(zhì)譜分析；同步分泌的 CD63 或 CD9 EV 的定量質(zhì)譜分析揭示了質(zhì)膜和內(nèi)體衍生的 EV 的特征，PM 蛋白在 CD9-EV 中富集，而內(nèi)體/溶酶體和 PM 跨膜蛋白都在 CD63-EV 中富集。
研究結(jié)論
這項(xiàng)工作旨在確定含有不同四跨膜蛋白的 EV 的實(shí)際外泌體或外泌體性質(zhì)。為了確定這些細(xì)胞釋放的 EV 的亞細(xì)胞起源，研究者通過時(shí)間控制的方式跟蹤四跨膜蛋白的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，從它們在內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 中的初始合成到它們在 EV 中的分泌。研究結(jié)果表明，CD63和CD9都可以在質(zhì)膜形成的小ectosomes中釋放，并且在HeLa細(xì)胞中，外泌體代表小EVs(sEVs) 的一個(gè)小亞群，它們攜帶CD63和其他晚期內(nèi)體分子，如LAMP1/2。它們的分泌特別容易受到內(nèi)體pH值的中和。BSG和SLC3A2被鑒定為HeLa細(xì)胞中ectosomes分泌的特定標(biāo)記物，相反對內(nèi)體pH中和不敏感。有趣的是，CD81是另一種常用作外泌體和/或小EV標(biāo)記物的四跨膜蛋白，其行為類似于CD9而不是CD63。此處確定的外泌體與ectosomes的特異性標(biāo)志物和分子機(jī)制將為進(jìn)一步研究以破譯它們各自的功能鋪平道路。