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γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶(GCL)檢測(cè)試劑盒(分光光度法 50T/48S)

貨號(hào) SH0547 售價(jià)(元) 456
規(guī)格 50T/48S CAS號(hào)
  • 產(chǎn)品簡(jiǎn)介
  • 相關(guān)產(chǎn)品

貨號(hào)

名稱(chēng)

規(guī)格

SH0547

γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶(GCL)檢測(cè)試劑盒(分光光度法 50T/48S)

50管/48樣

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義:

GCL GSH 合成的限速酶,GSH 對(duì) GCL 有反饋抑制作用。GCL基因表達(dá)受多種因素調(diào)節(jié),如氧化劑、抗氧化劑、生長(zhǎng)因子和炎癥因子等。GCL活性高低對(duì)GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影響。

測(cè)定原理:

ATPMg2+存在下,GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸;同時(shí)ATP去磷酸化產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷分子,通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷增加速率,即可計(jì)算出GCL活性。

組成:

產(chǎn)品名稱(chēng)

SH0547-50T/48S

Storage

試劑一:液體

70ml

4℃

試劑二:粉劑

1

4℃

試劑三:粉劑

1

4℃

試劑四:液體

16ml

室溫

試劑五:粉劑

1

4℃

說(shuō)明書(shū)

一份

 

試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加14ml蒸餾水充分震蕩溶解。

試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入蒸餾水3.5 ml充分震蕩溶解。

試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入30ml蒸餾水,充分震蕩溶解后,緩緩加入1.0 ml濃硫酸(自備),邊加邊攪拌。

自備儀器和用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)、冷凍離心機(jī)、水浴鍋、移液器、1ml玻璃比色皿、濃硫酸和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(ml)15~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g組織,加入1ml試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(ml)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1ml試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測(cè)。

3. 血清等液體:直接測(cè)定。

GCL測(cè)定操作

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到660 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管:取1.5mlEp管,依次加入試劑一240 μl、試劑二260μl、試劑三60μl蒸餾水120μl,混勻后蓋緊,37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)15 min; 再加入試劑四300μl,混勻后,25℃、8000g離心10 min,取上清500μl,加入試劑五500μl,混勻后蓋緊,45℃水浴10min,冷卻后測(cè)定660 nm處吸光值,記為A空白管。

3. 測(cè)定管:取1.5mlEp管,依次加入試劑一240 μl、試劑二260μl、試劑三60μl上清液120μl,混勻后蓋緊,37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)15 min; 再加入試劑四300μl,混勻后,25℃、8000g離心10 min,取上清500μl,加入試劑五500μl,混勻后蓋緊,45℃水浴10min,冷卻后測(cè)定660 nm處吸光值,記為A測(cè)定管。

注意:空白管只需要測(cè)定一次。

GCL活性計(jì)算公式:

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):y=0.1427x,R2=0.9987

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:37℃下,每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg無(wú)機(jī)磷的GCL酶活量為1個(gè)酶活單位。

GCLμg/min /mg prot=[A測(cè)定管-A空白管)÷0.1427×V反總]÷(Cpr×V)÷T

=3.815×A測(cè)定管-A空白管)÷Cpr

2)按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義:37℃下,每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg無(wú)機(jī)磷的GCL酶活量為為1個(gè)酶活單位。

GCLμg/min /g鮮重)= [A測(cè)定管-A空白管)÷0.1427×V反總]÷(W×V÷V樣總)÷T

= 3.815×A測(cè)定管-A空白管)÷W

3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義:37℃下,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg無(wú)機(jī)磷的GCL酶活量為1個(gè)酶活單位。

GCLμg/min /104 cell=[A測(cè)定管-A空白管)÷ 0.1427×V反總]÷(細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T

= 3.815×A測(cè)定管-A空白管)÷細(xì)胞數(shù)量

4)按照液體體積計(jì)算

活性單位定義:37℃下,每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μg無(wú)機(jī)磷的GCL酶活量為1個(gè)酶活單位。

GCLμg/min /ml= [A測(cè)定管-A空白管)÷ 0.1427×V反總]÷V÷T

=  3.815×A測(cè)定管-A空白管)

0.1427:回歸方程系數(shù);V反總:反應(yīng)總體積(ml980μl=0.980ml;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/ml;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,120μl =0.12 ml;V樣總:加入提取液體積,1ml;W:樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間:15min。

注意事項(xiàng):

1)樣品處理等過(guò)程均需要在冰上進(jìn)行,且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力,以免影響其活力。如果是勻漿液,避免反復(fù)凍融。

2)所有試劑配制完后,除表明4℃保存外,請(qǐng)于1天內(nèi)用完。

3)實(shí)驗(yàn)過(guò)程請(qǐng)帶手套,試劑三中有強(qiáng)腐蝕性物質(zhì),注意不要濺到皮膚上或眼睛內(nèi)。

4)測(cè)定吸光值時(shí)請(qǐng)于水浴后1040分鐘內(nèi)測(cè)完。

5)樣本測(cè)定前先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),如吸光值太高,應(yīng)先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當(dāng)倍數(shù),使得吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍內(nèi),哺乳動(dòng)物組織和血液一般稀釋35倍。

6)試劑三配制過(guò)程中,可能會(huì)產(chǎn)生黑色固體,其不影響結(jié)果,注意吸取時(shí)不要將黑色固體吸入。

7)細(xì)胞中GCL活性測(cè)定時(shí),細(xì)胞數(shù)目須在300萬(wàn)-500萬(wàn)之間,細(xì)胞中GCL的提取時(shí)可加試劑一(或生理鹽水)后研磨或超聲波處理,不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞;

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