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測(cè)定意義：

植酸酶（phytase）是催化植酸及其鹽類(lèi)水解為肌醇與磷酸（鹽）的一類(lèi)酶的總稱(chēng)，屬磷酸單酯水解酶，它能將食品和飼料中植酸及其鹽轉(zhuǎn)化為可供有機(jī)體利用的有效磷，降低糞便中的磷含量，減輕對(duì)環(huán)境的污染，改善營(yíng)養(yǎng)成分的吸收和利用，因此具有極其廣泛的研究和應(yīng)用價(jià)值。

測(cè)定原理：

植酸酶在一定溫度和pH值條件下，水解底物植酸鈉生成無(wú)機(jī)磷與肌醇衍生物，無(wú)機(jī)磷在酸性環(huán)境中與鉬酸銨顯色劑反應(yīng)生成藍(lán)色復(fù)合物，在700nm處有特征吸收峰，根據(jù)700nm處吸光值變化可計(jì)算得植酸酶活性。

試劑組成和配制：

試劑一：粉劑×1支，4℃保存，臨用前加緩沖液6ml配制，現(xiàn)用現(xiàn)配；用不完的試劑4℃保存一個(gè)月。

顯色劑：粉劑×8瓶，4℃保存，臨用前根據(jù)用量每瓶加0.4ml雙蒸水溶解，再加1.6ml試劑二混勻。

需自備儀器和用品：

天平、低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋，超聲溶解器，回旋式振蕩器。

樣本處理：

1. 酶制劑：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：500~1000的比例（建議稱(chēng)取約0.001g，加入1ml提取液）加入提取液，在超聲波溶解器上溶解15min，再用回旋式振蕩器振蕩15min，待測(cè)。

2. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g，加入1ml提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，在超聲波溶解器上溶解15min，再用回旋式振蕩器振蕩15min，4℃，4000g離心10min，取上清待測(cè)。

3. 飼料樣品：飼料烘干粉碎，過(guò)40目篩，按照質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g，加入1ml提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，在超聲波溶解器上溶解15min，再用回旋式振蕩器振蕩15min，4℃，4000g離心10min，取上清待測(cè)。

4.   培養(yǎng)液等液體樣品，混勻直接測(cè)定。

測(cè)定步驟：

37℃溫育5min

混勻，37℃溫育30min，95℃，10min終止反應(yīng)，冷卻至室溫

混勻，37℃靜置15min，10000g，室溫，離心5min，取上清200μl，測(cè)定700nm處吸光值，△A=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

注意事項(xiàng)

1、顯色劑需要臨用前根據(jù)用量配制，每一瓶是13個(gè)樣本的用量，新配制的顯色劑若有顏色則已經(jīng)污染或者試劑過(guò)期，應(yīng)放棄使用。

2、ΔA線(xiàn)性范圍為0.01-1。

酶活性計(jì)算公式：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y = 0.2764x + 0.0082，R2 = 0.9998；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/ml），y為吸光值。

1． 按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：在37℃，pH5.5的條件下，每毫克蛋白每分鐘從5mmol/L的植酸鈉溶液中釋放出1μmol的無(wú)機(jī)磷為一個(gè)酶活力單位。

植酸酶活性（μmol/min/mg prot）=（△A-0.0082）÷0.2764÷Cpr÷T =0.1206×（△A-0.0082）÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在37℃，pH5.5的條件下，每克樣本每分鐘從5mmol/L的植酸鈉溶液中釋放出1μmol的無(wú)機(jī)磷為一個(gè)酶活力單位。

植酸酶活性（μmol/min /g 鮮重）=（△A-0.0082）÷0.2764÷W÷T =0.1206×（△A-0.0082）÷W

3. 培養(yǎng)液等液體樣品

酶活性定義：在37℃，pH5.5的條件下，每毫升液體每分鐘從5mmol/L的植酸鈉溶液中釋放出1μmol的無(wú)機(jī)磷為一個(gè)酶活力單位。

植酸酶活性（μmol/min /ml）=（△A-0.0082）÷0.2764÷T =0.1206×（△A-0.0082）

Cpr：樣本蛋白含量，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。

b. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y = 0.1382x + 0.0082，R2 = 0.9998；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/ml），y為吸光值。

1.按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：在37℃，pH5.5的條件下，每毫克蛋白每分鐘從5mmol/L的植酸鈉溶液中釋放出1μmol的無(wú)機(jī)磷為一個(gè)酶活力單位。

植酸酶活性（μmol/min/mg prot）=（△A-0.0082）÷0.1382÷Cpr÷T = 0.2412×（△A-0.0082）÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在37℃，pH5.5的條件下，每克樣本每分鐘從5mmol/L的植酸鈉溶液中釋放出1μmol的無(wú)機(jī)磷為一個(gè)酶活力單位。

植酸酶活性（μmol/min /g 鮮重）=（△A-0.0082）÷0.1382÷W÷T =0.2412×（△A-0.0082）÷W

3. 培養(yǎng)液等液體樣品

酶活性定義：在37℃，pH5.5的條件下，每毫升液體每分鐘從5mmol/L的植酸鈉溶液中釋放出1μmol的無(wú)機(jī)磷為一個(gè)酶活力單位。

植酸酶活性（μmol/min /ml）=（△A-0.0082）÷0.1382÷T =0.2412×（△A-0.0082）

Cpr：樣本蛋白含量，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。