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測(cè)定意義：

淀粉磷酸化酶（Starch Phosphorylase，SP）是淀粉代謝過(guò)程唯一的可逆反應(yīng)酶，既可催化淀粉的合成，也可催化淀粉的分解。

在高等植物中，淀粉磷酸化酶（合成方向）主要存在于質(zhì)體中，負(fù)責(zé)延長(zhǎng)淀粉的 α-1,4-葡萄糖鏈的非還原末端；淀粉磷酸化酶（分解方向）主要存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，催化淀粉中的α-1,4-糖苷鍵磷酸解產(chǎn)生葡萄糖-1-磷酸，負(fù)責(zé)葡萄糖鏈的磷酸解，是淀粉代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶。

在植物體中，淀粉磷酸化酶分解方向的底物無(wú)機(jī)磷濃度比合成方向的底物葡萄糖-1-磷酸濃度幾乎高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，一般認(rèn)為淀粉磷酸化酶只催化淀粉的分解，因此，分解方向的淀粉磷酸化酶具有重要測(cè)定意義。

測(cè)定原理：

淀粉磷酸化酶催化淀粉中的α-1,4-糖苷鍵與無(wú)機(jī)磷反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖-1-磷酸，葡萄糖-1-磷酸在磷酸葡萄糖變位酶的作用下產(chǎn)生葡萄糖-6-磷酸，并在6-磷酸葡萄糖脫氫酶催化下還原NADP+產(chǎn)生NADPH，使340nm下吸光值增加。

組成：

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入1.5ml水溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存；

試劑三：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入1.5ml水溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存。

自備儀器和用品：

酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心10min，取上清待測(cè)。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1ml提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm；

2、 工作液的配制：臨用前按照樣本量將試劑一、試劑二、試劑三按照170μl:10μl:10μl的比例混合，臨用前配制，半小時(shí)內(nèi)使用。

3、 在96孔板中加入10μl樣本和190μl工作液，立即混勻，記錄340nm處1min時(shí)的吸光值A1和6min時(shí)的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

SP活力單位的計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

SP（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T

=1286×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

SP（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T

=1286×ΔA÷W

（3）按樣本細(xì)胞計(jì)算

單位定義：每萬(wàn)個(gè)細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

SP（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(細(xì)胞數(shù)量 ×V樣÷V樣總)÷T

=2.572×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；細(xì)胞數(shù)量，500萬(wàn)。