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正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義：

PAL（EC4. 3 1 5）廣泛存在于各種植物和少數(shù)微生物中，是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶，與一些重要的次生物質(zhì)如木質(zhì)素、異黃酮類植保素、黃酮類色素等合成密切相關(guān)，在植物正常生長(zhǎng)發(fā)育和抵御病菌侵害過(guò)程中起重要作用。

測(cè)定原理：

PAL催化L-苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸和氨，反式肉桂酸在290nm處有最大吸收值，通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率計(jì)算PAL活性。

組成：

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入4ml蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑4℃保存；

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至290nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 準(zhǔn)備96孔UV板一塊（非普通酶標(biāo)板，普通酶標(biāo)板只能透過(guò)可見(jiàn)光，不能透過(guò)紫外光，檢測(cè)波長(zhǎng)小于340nm務(wù)必使用UV板）。

3、在EP管或96孔UV板中按順序加入下列試劑

混勻，30℃ 準(zhǔn)確反應(yīng)30min

混勻，靜置10min后， 290nm處記錄測(cè)定管吸光值A1和對(duì)照管吸光值A2，△A=A1-A2。

注意：對(duì)照管只要做一管

PAL活性計(jì)算：

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白在每ml反應(yīng)體系中每min使290nm下吸光值變化0.1為一個(gè)酶活性單位。

PAL（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（Cpr× V樣）÷0.1÷T =13.3×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織在每ml反應(yīng)體系中每min使290nm下吸光值變化0.1為一個(gè)酶活性單位。

PAL（U/g鮮重）＝ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.1÷T =13.3×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2ml； V樣：加入樣本體積，0.005ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。

用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白在每ml反應(yīng)體系中每min使290nm下吸光值變化0.05為一個(gè)酶活性單位。

PAL（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.05÷T =26.6×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織在每ml反應(yīng)體系中每min使290nm下吸光值變化0.05為一個(gè)酶活性單位。

PAL（U/g鮮重）＝ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.05÷T =26.6×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2ml； V樣：加入樣本體積，0.005ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。