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PfAgo核酸內(nèi)切酶（PfAgo Endonuclease）來(lái)源于重組大腸桿菌，含有從激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）中克隆的Argonaute（Ago）核酸酶基因，是一種依托引導(dǎo)序列（guide DNA）與靶核酸堿基互補(bǔ)配對(duì)，繼而特異識(shí)別并剪切靶核酸的核酸內(nèi)切酶。PfAgo 核酸內(nèi)切酶在5′磷酸化的guide DNA（大于15 nt）引導(dǎo)下精準(zhǔn)剪切單鏈DNA底物，剪切位點(diǎn)位于與引導(dǎo)序列互補(bǔ)的5′端開始的第10和第11個(gè)核苷酸之間，剪切不受靶標(biāo)序列和剪切位點(diǎn)相鄰序列限制。本產(chǎn)品于95℃ 1 小時(shí)，酶活性不損失。

包裝量與儲(chǔ)存條件：

JY0316包裝量為JY0316-S和JY0316-L，各組分于-20℃及以下運(yùn)輸及保存，有效期為24 個(gè)月。長(zhǎng)期保存建議放-80℃。

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使用方法：

1、?自備以下儀器、試劑及耗材，輔助完成后續(xù)PfAgo?Endonuclease切割反應(yīng)。

①儀器：PCR 儀器（ABI7500、 QuantStudio 5、Stepone plus）、金屬浴或水浴鍋；

②試劑：40 mM Mn²⁺( Nuclease-free H₂O配制)、Nuclease-free H₂O；

③合成引物：guide DNA：5′?P-TTTGGAGCTGGTGGCG 3′；

ss DNA：5′-6-FAM-CCTACGCCACCAGCTCCAACTACCACAA-BHQ1 3′?；

? ④耗材：Nuclease-free free EP 管。

2、按下表，配制反應(yīng)體系，并混合均勻。

注：一般使用20 μL 體系，但也可以等比例放大；

? ? ? 試驗(yàn)前用Nuclease-free H₂O將ssDNA 、guide DNA 稀釋至相應(yīng)濃度。

2、95℃孵育30 min。

3. 反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行核酸膠電泳分析。如果不立即電泳，可以加入EDTA 終止反應(yīng)，并先凍存于-20℃。

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圖1.對(duì)照DNA的酶切結(jié)果? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖2 酶活檢測(cè)曲線圖

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