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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡介

一種細(xì)胞滲透型的dihydro-X-rosamine衍生物，包含標(biāo)記線粒體的弱巰基反應(yīng)性的氯甲基官能團(tuán)。本品是一種還原型的紅色熒光染料（Ex=579 nm，Em=599 nm），本身不發(fā)熒光。只需簡單孵育細(xì)胞，即可被動運(yùn)輸穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后被氧化為發(fā)熒光且具線粒體選擇性的探針，聚集在活性線粒體上。一旦線粒體被染色后，還能根據(jù)后續(xù)實驗的需求進(jìn)行固定（醛類固定劑如甲醛）和透化（醛類去污劑如Triton X-100），探針依然維持在細(xì)胞內(nèi)。本品適合雙標(biāo)實驗，因其紅色熒光與其他的綠色熒光探針具有良好的分辨率。

雖然傳統(tǒng)的線粒體熒光探針如TMR和羅丹明123，也能很容易的聚集在功能線粒體上，但是一旦線粒體膜電位喪失即會被洗掉，從而在一些需要細(xì)胞進(jìn)行醛類固定或者包含線粒體能量狀態(tài)影響因子的實驗中，使其應(yīng)用大受限制。

使用方法

1儲存液的配制

本品是以粉末形式提供，使用前需將本品回溫至室溫。

之后使用細(xì)胞培養(yǎng)級別的無水DMSO將其充分溶解至終濃度1 mM。

本品M. Wt.= 497.08 g/mol，換算下來，50 μg粉末只需加入100.6 μL DMSO即可得到1 mM儲存液。根據(jù)單次的使用量將儲存液分裝后放到-20℃避光，避免反復(fù)凍融。特別注意:由于本品是還原型的化合物，對氧氣相當(dāng)敏感，特別是在溶液中，為了保持產(chǎn)品的穩(wěn)定性，產(chǎn)品分裝后充氮氣或者氬氣等惰性氣體以防止在凍存的過程中被氧化。

2工作液的配制

根據(jù)不同的實驗?zāi)康氖褂貌煌奶结槤舛?，以下的起始操作條件僅作參考，可根據(jù)細(xì)胞類型和其他的相關(guān)因素如細(xì)胞或組織的透化等進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

用適當(dāng)?shù)木彌_液或細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋1 mM儲存液至工作液濃度。一般推薦使用濃度為25-500 nM。對于后續(xù)需要做固定或透化的樣本，推薦工作濃度為100-500 nM，為了降低過度加載導(dǎo)致的潛在偽影和線粒體毒性，在不影響實驗結(jié)果的前提下應(yīng)盡可能低濃度染色。另外，濃度過高也可能對其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色。

注意：1）本品是還原型的熒光探針，使用的工作液濃度比氧化型的濃度一般高3~5倍。以上推薦的濃度是針對氧化型，請使用本品（還原型）時進(jìn)行適當(dāng)?shù)臐舛日{(diào)整。2）血清中可能含氧化酶，影響本還原型探針的穩(wěn)定性。則不建議使用含血清的完全培養(yǎng)基稀釋儲存液。

3染色及檢測

1）壁細(xì)胞的染色

培養(yǎng)皿/板內(nèi)加入適量的培養(yǎng)基覆蓋蓋玻片進(jìn)行爬片培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長至所需豐度，吸除培養(yǎng)液，加入37℃預(yù)熱的染色工作液。在所使用細(xì)胞正常培養(yǎng)條件下孵育15-45 min（最佳孵育時間需優(yōu)化）。染色結(jié)束后，使用新鮮培養(yǎng)液或緩沖液替換上述染色液，即可將其置于熒光顯微鏡下觀察或熒光酶標(biāo)儀下讀數(shù)?；蛘哌M(jìn)行后續(xù)的固定和透化步驟，見步驟4。

2）浮細(xì)胞的染色

離心收集細(xì)胞，吸除上清，利用37℃預(yù)熱的染色工作液輕輕重懸細(xì)胞。在所使用細(xì)胞正常培養(yǎng)條件下孵育15-45 min（最佳孵育時間需優(yōu)化）。染色結(jié)束后，離心收集細(xì)胞，利用37℃預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)液或緩沖液重懸細(xì)胞，被染色的細(xì)胞可用流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡進(jìn)行分析。

如果需要蓋玻片上固定化的細(xì)胞，那么可在鋪片前先用多聚賴氨酸（poly-D-lysine）包被載玻片或蓋玻片?；蛘哌M(jìn)行后續(xù)的固定和透化步驟，見步驟4。

4固定和透化

1）色結(jié)束后，利用培養(yǎng)液或緩沖液清洗細(xì)胞；

2）心吸走清洗液。換用新鮮配制且預(yù)熱的含2-4%甲醛的緩沖液或培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞固定。經(jīng)驗證， 本染料由含3.7%甲醛的完全培養(yǎng)液于37℃孵育內(nèi)皮細(xì)胞15min能起到良好的固定效果。

3）洗細(xì)胞：吸除固定液，用適當(dāng)緩沖液沖洗細(xì)胞數(shù)次。

4）胞透化（可選）：

像ICC等實驗需要細(xì)胞要做透化，則可將已固定的細(xì)胞直接加入含有去污劑如Triton X-100的緩沖液中孵育。透化結(jié)束后，用緩沖液清洗細(xì)胞即可進(jìn)行后續(xù)ICC實驗。經(jīng)檢測，利用含0.2% Triton X-100的PBS孵育內(nèi)皮細(xì)胞10min可以達(dá)到良好的透化效果。

另外，還可利用預(yù)冷的丙酮透化5 min，之后用PBS清洗細(xì)胞。經(jīng)驗證，即使后繼沒有進(jìn)一步的抗體標(biāo)記，丙酮透化處理也可降低背景信號。

注意事項

1）DMSO有毒，使用時請小心操作。

2）了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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